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加减十灰散对急性肝功能衰竭大鼠血清内毒素和肿瘤坏死因子水平的影响


□ 欧阳钦王晓东

  关键词 加减十灰散 炭性中药 急性肝功能衰竭 内毒素 肿瘤坏死因子 大鼠
  
  本实验通过大鼠急性肝功能衰竭造模、加减十灰散灌胃,观察大鼠血循环中内毒素及肿瘤坏死因子水平的变化,以及观察肝组织病理切片改变情况,验证加减十灰散,尤其是其中炭性中药的疗效,为临床使用本方治疗急性肝功能衰竭患者提供实验依据。
  
  1 材料与方法
  1.1 材料:包括实验动物、实验药品及检测试剂等。
  1.1.1 实验动物: 90只雄性SD大鼠,平均体重200±8.2g,(购自浙江医学科学院实验动物中心),置室温(22±3)℃,湿度60%~75%,实验室适应环境3d后进行实验。
  1.1.2 实验药品:加减十灰散,本院制剂室制备。组成:棕榈炭、血余炭、藕节炭、茵陈、栀子、大黄、白茅根、茜草、蒲公英。其中炭性药物碾成极细粉末,其它药物煎水浓缩至适量。
  1.1.3 实验室检测:血清内毒素(ET)检测:ET试剂盒购自上海市临床检验中心,其测定采用鲎试验偶氮基质显色法[1]。肿瘤坏死因子(TNF-α)检测:TNF-α试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所,其含量检测采用放免法。
  1.1.4 病理组织切片检查:采用中性福尔马林液固定制备SD大鼠肝脏的病理切片,HE染色光镜检查。
  1.2 方法:包括模型制作、分组用药及统计方法等。
  1.2.1 急性肝脏功能衰竭大鼠模型制作:氨基半乳糖(D-GalN)(购自重庆医科大学教研室,批号20050268),用前将其溶于无菌生理盐水中,用1mol/L NaOH调节PH至7.0,使最终浓度为10%,根据文献[2],以D-GalN 1.2g/kg 作为最佳中毒剂量,腹腔注射一次成模。
  1.2.2 动物分组及用药:实验大鼠随机分为5组:① 正常对照组(Ⅰ组)10只:系非造模大鼠,自由饮用饲料。其余80例均系D-GalN造模大鼠。② 肝衰竭模型组(Ⅱ组)20只:D-GalN造模24 h后眼眶采血检测ET及TNF-α,并剖杀制作病理切片,观察肝组织受损情况。③ 生理盐水组(Ⅲ组)20只:每只大鼠生理盐水4ml/次,2次/日灌胃。④ 加减十灰散组(Ⅳ组)20只:棕榈炭、血余炭、藕节炭等炭性中药各等份研成极细的粉末,每只大鼠1g,2次/日,以茵陈480g, 栀子、白茅根、茜草、蒲公英各240g,大黄120g,煎水2400ml,2~8℃冰箱保存,每只大鼠灌服4ml/次,2次/日,灌胃送服上述炭性粉末。⑤ 加减十灰散去炭性中药组(Ⅴ组)20只,取上述煎剂每只大鼠4ml/次,2次/日灌胃。以上Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组喂养7天后,均予眼眶采血检测ET及TNF-α,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组采血后剖杀取肝组织制作病理切片。
  1.3 统计学处理:计数资料采用χ2检验,样本均数比较采用F检验及t检验,用SPSS11.5统计学软件进行处理。
  
  2 结果
  2.1 造模小鼠各组存活情况:见表1。三组之间总的比较存在整体差异,χ2=1.87 ,P<0.05。两两比较:Ⅲ与Ⅳ比较有显著性差异,χ2=8.12,P<0.01。Ⅲ与Ⅴ比较无显著性差异,χ2=2.558,P>0.05。Ⅳ与Ⅴ比较无显著性差异,χ2=1.758,P>0.05。说明十灰散能明显提高急性肝衰竭大鼠的生存率。
  
  2.2 各组血清内毒素(ET)及肿瘤坏死因子(TNF-α)检测结果:见表2。数据经方差齐性检验后,各组间的方差具有齐性(F=94.112、P=0.149),ET与TNF-α呈明显正相关。Ⅱ组与Ⅰ组比较,均有显著性差异,P<0.01 ;Ⅲ组与Ⅳ组比较 ,有显著性差异,P<0.01 ;Ⅲ组与Ⅴ组比较 ,有显著性差异,P<0.01;Ⅳ组与Ⅴ组比较,有显著性差异,P<0.01;Ⅱ组与Ⅲ组比较,无显著性差异,P>0.05。
  
  3 讨论
  肝脏是体内最大的代谢器官,是清除内毒素和解毒的主要脏器,动物及体外实验结果显示,肝损伤后,TNF-α等细胞因子的产生是由于肝病时内毒素激活单核巨噬细胞的结果。研究发现,急性肝功能衰竭患者中,脂多糖内毒素(LPS)浓度和TNF-α水平明显升高,且呈正相关。藏国庆[3]等分别注射ET和TNF-α于半乳糖胺致敏的BALB/c小鼠,造成肝衰竭模型,发现TNF-α是内毒素血症中造成肝细胞调亡的终未介质,肝细胞调亡存在于整个病程中,而坏死则在病程后期出现,调亡的肝细胞可通过各种途径,引起肝细胞坏死。对肝功能衰竭患者,目前临床消除循环内毒素的有效方法是以血液净化为基础的体外循环疗法——人工肝脏,如血浆置换、血液灌流等,而对肠源性内毒素的消除,传统中医药口服或灌肠有其独特的疗效。现代药理研究表明,黄芪、人参、丹参、川芎等可促使内毒素灭活,穿心莲、板蓝根等对内毒素有破坏作用,大黄、黄连、栀子等可抑制细菌的生长,减少内毒素的产生,大黄、芒硝等可阻止内毒素在肠道内滞留,从而减少内毒素的产生,蒲公英等可保护线粒体结构及活力,防止内毒素所致的过氧化损伤,丹参等可以纠正内毒素血症引起的肝脏微循环障碍[4]。加减十灰散中,血余炭、棕榈炭、藕节炭三种炭性中药能改善肝脏的微循环,尤其是血余炭。现代药理研究表明,血余炭的主要成份是一种优质蛋白,能明显缩短出凝血时间,棕榈炭、藕节炭含有大量纤维及鞣质,具有很强的吸附肠源性内毒素的作用,并能缩短出凝血时间,改善肝功能衰竭患者的凝血酶原活动度,配合茵陈、栀子、大黄,再与凉血活血的茜草,清血分热的白茅根,清热解毒的蒲公英合用,共奏清热利湿解毒,活血祛瘀通腑之效。本实验研究证实,加减十灰散能明显降低ET及TNF-α水平,提高急性肝衰竭大鼠的生存率。
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