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柳树叶提取物诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡的实验研究


□ 王 伟 杨肃文 方嘉坚

  摘要 目的:研究柳树叶水提物抗肿瘤作用,为最终提取一种有效抗肿瘤药物及临床前实验提供依据。方法:柳树叶水提物制备药物血清作用于培养的肝癌细胞株hep-G2,检测其凋亡。采用端粒重复序列扩增(TRAP)法结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测端粒酶活性。结果:柳树叶水提物制备药物血清对靶细胞有明显的抑制生长现象。孵育一段时间后,能使肝癌细胞发生凋亡,并呈现对浓度的依懒性和伴随端粒酶活性下降。结论:柳树叶提取物能诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡。
  关键词 柳树叶提取物 肝癌细胞株hep-G2 肿瘤细胞凋亡 实验研究
  
  柳树叶中含有挥发油和大量糖苷类化合物及酚类化合物,其水提浸膏早已被证实具有消炎止痛、活血化瘀的作用[1],常用于外用药的组方中,用于治疗跌打损伤、腰肌劳损等病症,近年来还用于治疗癌性疼痛。国外有研究表明柳枝水萃取物能够显著抑制肿瘤细胞生长[2],但机理尚不明确。本实验研究以肝癌细胞株hep-G2作为靶细胞,探讨柳树叶水提物诱导其凋亡的可行性。用柳树叶水提物对SD大鼠灌胃,制备药物血清,将药物血清加入体外培养液中进行肝癌细胞株hep-G2培养。观察药物血清对肿瘤细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 药物血清的制备:分述如下。
  1.1.1 实验材料:柳树叶水提物、SD大鼠、注射器、灌胃针、解剖剪、解剖镊、无菌试管、微孔滤膜、吸管、橡皮头、台式低速离心机、冰箱、真空干燥灭菌柜。
  1.1.2 实验步骤:①柳树叶水提物分高浓度(15mg/kg,即每千克SD大鼠灌15mg柳树叶水提物)、中浓度(10mg/kg)、低浓度(5mg/kg)对SD大鼠进行灌胃。对照组用生理盐水灌胃,每组6只SD大鼠。②3周后于无菌条件下分别打开灌胃过的SD大鼠腹腔,由下腔静脉抽血,同组大鼠血装于事先编号的同一无菌试管内,混匀。血液在室温下放置3h,使血液凝固,然后移至4℃冰箱中过夜,使血清充分析出。③第2天将各试管血清在4℃,4000r/min条件下离心20min,使血清析在上层,吸取另装,然后用0.22um的微孔滤膜过滤除菌,再放于真空干燥灭菌柜里53℃灭火30min后,保存于-20℃冰箱待用。
  1.2 细胞培养:分述如下。
  1.2.1 实验材料:超净台(TH-420)、二氧化碳培养箱(For ma311)、低速台式离心机(Beckman)、倒置显微镜(SANYO)、培养瓶、无菌吸管、橡皮头、试管架、酒精灯、酒精棉球、废液缸、标记笔、灭菌工作服、口罩、帽子、磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞消化液(0.25%胰蛋白酶)、细胞培养液(含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基)、含100ml/L药物血清和对照血清的RPML1640培养液、肝癌细胞株hep-G2、细胞计数板。
  1.2.2 实验步骤:①将药物血清和对照血清分别配成100ml/L的RPML1640培养液备用。②将hep-G2细胞培养于RPMI1640培养液中放于二氧化碳培养箱(37℃,5%CO2,饱和湿度)中培养。③从培养箱中取出培养瓶,显微镜下观察。当细胞培养瓶中的细胞长成致密单层时,在酒精灯旁打开瓶塞,倒去瓶中旧培养液,加入1~2ml 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准),室温静置2~10min,于倒置显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时则吸去胰蛋白酶液,加入新培养液。用吸管吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,直至瓶壁细胞全部脱落下来为止。再轻轻吹打细胞悬液,使细胞分散,吸取1ml细胞液,将细胞液滴于细胞计数板上记数。将剩余细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡后,将离心管放入台式离心机中,以1000r/min离心5min。弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液,根据记数结果将细胞悬液分装于2~3个培养瓶中,使每个培养瓶接种上约106个细胞,再加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内,放入培养箱中培养,预培养24h。然后分别换药物血清培养液和对照组培养液培养6d。将经药物血清作用过的hep-G2分成两份,一份采用Annexin-v法对肝癌细胞进行Annexin-v和PI双染色,上流式细胞仪检测,观察药物血清对肿瘤细胞凋亡的影响。再采用端粒重复序列扩增(TRAP)法,对另一份hep-G2进行检测,观察药物血清对体外培养的hep-G2的端粒酶活性的影响。
  1.3 细胞凋亡检测:分述如下。
  1.3.1 实验材料:流式细胞仪(Bdlsrfsc)﹑低速台式离心机(Beckman)﹑吸管﹑试管﹑离心管﹑试管架﹑PBS液﹑Annexin V/PI试剂盒。
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