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三七总皂苷对糖尿病大鼠肾皮质p22phoxmRNA表达的影响


□ 傅珍春 徐 刚 于淑娟

  糖尿病肾病(DN)的发病机制尚不完全清楚,目前已知氧化应激反应增强、活性氧(ROS)产生增多在糖尿病肾病的发生发展中发挥了重要的作用。最近,NAD(P)H氧化酶因参与氧化应激过程而受到关注,P22phox是NAD(P)H氧化酶的一个必需亚单位,在维持其活性中起重要作用。临床研究表明中药三七对DN有着良好的疗效,本实验通过观察三七总皂苷(PNS)对糖尿病大鼠肾皮质p22phox mRNA表达的影响及其对肾脏的保护作用,以探讨三七总皂苷防治DN的作用机制。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 实验动物:SD清洁级3月龄大鼠35只,雄性,体重150~200g,浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室,室温21~25℃。
  1.2 试剂:链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品;血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品;血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供;尿蛋白定量测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供;总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供;DNA梯度Marker由Takara公司提供。
  1.3 引物:搜索Genbank数据库大鼠p22phox mRNA序列,利用Primer Premier引物设计与分析软件设计p22phox及内参GAPDH引物,委托上海生工生物工程公司合成,序列如下:p22phox引物:上游:5’-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3’,下游:5’-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3’,目标长度:485bp;GAPDH引物:上游:5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’,下游:5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’,目标长度:276bp。
  1.4 方法与步骤:分述如下。
  1.4.1 造模、分组及治疗:适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组,6只)和造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%的溶液,放于冰浴中。糖尿病造模组大鼠禁食不禁水14小时,将STZ以65mg/kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模,两小时后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后至少连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖>16.65mmol/L,尿量>原尿量的150%,饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准[1,2]。造模后选取符合成模标准,状态稳定的糖尿病大鼠(24只),随机分为糖尿病模型组(DM组,8只),三七总皂苷组(PNS组,8只)和氨基胍组(AG组,8只,在实验过程中死掉1只),并予药物进行干预。其中,PNS组给予三七总皂苷100mg·kg-1·d-1灌胃,AG组给予氨基胍100mg·kg-1·d-1灌胃,DM组及NC组给予生理盐水1ml·100g-1·d-1灌胃。共8周。
  1.4.2 标本收集与处理:用药后8周末于处死大鼠前一天,用代谢笼收集大鼠24h尿标本,记录尿量后取5ml保存于-30℃冰箱中;大鼠称重后,从股静脉采血,分离血清待测;随后处死大鼠,取双肾,去掉肾包膜称重,右肾用10%中性福尔马林溶液固定,行PAS染色,左肾液氮冷冻,-70℃冰箱冻存,提取RNA。
  1.4.3 指标检测:采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖,用考马斯亮兰法检测尿蛋白,并计算24小时尿蛋白定量。
  1.4.4 肾组织病理学检查及肾小球细胞外基质的检测:取适量右肾组织行石蜡包埋,制成厚度为3 μm切片,行PAS染色,光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用北京航空航天大学全自动图像分析系统对PAS染色切片进行分析,每张切片按顺时针方向随机取10个完整正切肾小球,经分析系统计算每个肾小球PAS阳性染色面积与整个肾小球面积之比值,然后求10个肾小球此比值的均数,即为每张切片肾小球细胞外基质(ECM)的相对含量[3]。
  1.4.5 肾皮质p22phox mRNA的检测:分别取各组大鼠肾皮质100mg,按Trizol试剂说明书操作,提取总RNA,所得RNA用紫外分光光度计测260nm/280nm处的紫外吸收值(OD值),每个样品重复测3次。结果:所提取的RNA,A260/280比值约在1.8~2.0。将所提取的总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带,证实RNA无降解。
  取5μg RNA样品,1μl Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μl薄壁PCR管中,用灭活DEPC水补足至10μl,混匀。65℃加热10min,迅速冰水浴5min,短暂离心。按下列顺序加入:5×Buffer 4μ,dNTP(10mM)1μl,RNA酶抑制剂0.5μl,M-MLV逆转录酶(200U/μl)0.8μl,DEPC水最终补足至20μl混匀,42℃保温60min,95℃加热5min,立即冰水浴冷却5min,短暂离心。反应产物-20℃冻存。
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