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电针对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内血管生长因子和血管抑制因子表达的影响


□ 马璟曦 罗 勇

  [摘要]目的:探讨电针对缺血性脑卒中的作用机制。方法:线栓法制备Wistar大鼠局灶脑缺血再灌注模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、电针组。选取双侧“合谷”穴为电针穴位,采用原位杂交法检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达,免疫组化法检测血管生成素(Ang-1)和内皮抑素(Endostatin)蛋白的表达。结果:模型组VEGF mRNA、Ang-1蛋白、Endostatin蛋白的表达较正常组增加(P<0.05),电针组VEGF mRNA、Ang一1蛋白比模型组增加更明显(P<0.05),而Endostatin蛋白表达增加较模型组明显下降,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:电针可能通过上调血管生长因子和下调血管抑制因子的表达来促进局灶脑缺血再灌注后的血管新生。
  [主题词] 电针;再灌注损伤/针灸疗法;血管内皮生长因子类/针灸效应;基因表达/针灸效应
  文章编号:0255-2930(2007)02-0129-05
  中图分类号:R246.1 文献标识码:A
  
  脑缺血后,尽快恢复缺血区的血供,挽救濒临死亡的神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞,是治疗缺血性脑血管病的关键。既往较注重对神经元的研究,而对血管内皮细胞关注不够。除扩管、抗凝、溶栓等传统治疗手段外,以刺激脑内毛细血管生成的干预措施可能成为新的临床治疗手段。局灶脑缺血后,新形成的侧支血管可明显改善缺血区周围的组织灌流,血管新生可促进脑缺血后的神经功能恢复。近年研究发现,血管生长因子和血管抑制因子的动态变化共同影响脑缺血后的血管新生。本文研究局灶脑缺血再灌注及电针干预对血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang-1)、内皮抑素(En—dostatin)在大鼠脑内表达的影响,观察血管生长因子和血管抑制因子的动态变化,从新的角度阐释和理解电针的作用机理。
  
  1材料与方法
  1.1实验分组
  大鼠随机分为正常组(6只)、局灶脑缺血再灌注模型组(模型组,42只)、局灶脑缺血再灌注加电针治疗组(电针组,42只)。后两组分为局灶脑缺血1h再灌注后2h、12h、24h、3d、7d、14d、21d共7个亚组,每个亚组6只。正常组不做特殊处理。1.2局灶脑缺血再灌注模型的制备
  成年雄性健康Wistar大鼠90只,250~300 g,由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供[动物合格证编号:SCXK(渝)20020002]。线栓法制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血再灌注模型。3.5%水合氯醛腹腔麻醉(1 mL/100 g),大鼠仰卧位固定,经颈部正中切口依次暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉颅外段。在颈外动脉残端做一环形切口,将用聚胺酯预先处理的栓子尼龙绳线,直径约0.23 mm,向颈内动脉颅内方向插入17~20 mm,遇阻力表明线栓头端已通过大脑中动脉起始部,实现缺血。1h后拔回线栓至颈外动脉的残端,实现再灌注。模型成功的判断标准:①左侧肢体疼痛回缩迟钝或不出现;②行走时向左侧偏倒或原地向左侧旋转;③提尾倒悬时左上肢不向前下伸;④右侧出现Honer氏征。
  1.3 电针刺激方法及参数
  电针组:参照中国针灸学会实验针灸委员会实验动物穴位图谱,选取双侧“合谷”穴(LI 4)为电针穴位。局灶脑缺血后45 min,电针刺激上述穴位。每次电针时间为15 min。对超过Id的时相点,每日电针1次,最多电针7d,7d后自然喂养,不做特殊处理。刺激参数:疏密波F1=40 Hz,F2=60 Hz,空载输出电压1.5 V。
  1.4取材
  每组动物到达相对应时相点时,大鼠麻醉后用生理盐水200 mL快速左心室灌注冲洗,再用4%多聚甲醛(加0.1%的DEPC)500 mL先快后慢灌注固定,断头取脑,制备石蜡切片,以缺血区周围为观察部位,取相邻切片分别用于原位杂交、免疫组化检测。
  1.5 VEGF mRNA原位杂交检测
  采用VEGF mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)。杂交前处理:切片脱蜡至水,3%柠檬酸一胃蛋白酶液处理切片3 min,1%多聚甲醛(pH7.4的0.1 mol/L PBS配制,加0.1%的DEPC)后固定。杂交:滴加预杂交液,39℃预杂交6h,滴加适量的杂交液,盖上原位杂交盖玻片41℃过夜。杂交后洗涤:分别用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC洗涤。依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛抗体、SABC、生物素化过氧化物酶。DAB显色、脱水、透明、封片。
  1.6 Ang一1和Endostatin蛋白免疫组化检测
  切片脱蜡至水,抗原热修复92~98℃15 min,滴加封闭液,分别滴加1:100兔抗大鼠Ang一1抗体(武汉博士德公司)和1:100兔抗大鼠Endosta—tin抗体(武汉博士德公司),4℃过夜,滴加SABC。DAB显色、脱水、透明、封片。
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