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针刺血清对体外培养破骨细胞数量的影响


□ 赵英侠 王 静等

针刺血清对体外培养破骨细胞数量的影响
赵英侠 王 静等

  [摘要]目的:探讨针刺抑制骨吸收的细胞学机制。方法:40只12月龄雌性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、针刺预防组和针刺治疗组。针刺预防组和针刺治疗组分别在造模术后的3 d、3个月开始针刺。取“肾俞”“脾俞”“足三里”“大椎”。自新生SD大鼠四肢长骨分离破骨细胞,接种于24孔培养板中,加入含10%上述各组大鼠血清的培养液培养48 h后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并计数TRAP(+)多核细胞数。结果:与假手术组比较,模型组TRAP(+)多核细胞数明显增加(P<0.01);与模型组比较,针刺预防组和针刺治疗组TRAP(+)多核细胞数明显减少(P<0.05)。结论:针刺血清能够减少破骨细胞的数量,预防组和治疗组之间的作用无统计学差异。
  [主题词]绝经后期;骨质疏松/针灸疗法;破骨细胞/针灸效应;体外发生
  
  绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO)是绝经后妇女常见的骨代谢性疾病,因其引起骨痛、骨折等并发症,严重影响了绝经后妇女的健康和生存质量,近年来日益受到广泛重视。针灸学者根据“肾主骨”及“肾为先天之本,脾为后天之本”等中医基础理论,并结合骨质疏松症“多虚多瘀”的特点,以补肾健脾、活血通络为治疗原则选穴处方治疗绝经后骨质疏松症取得了较为满意的疗效,但对针刺作用的细胞学机制了解甚少。本课题组以往在体实验研究结果显示,针刺可以改善去除卵巢大鼠尿液中与骨吸收相关的生化指标。在上述研究基础上,本课题组采用体外破骨细胞培养技术,并借鉴血清药理学方法,进行了针刺血清对体外培养破骨细胞数量影响的离体实验研究,目的是进一步探讨针刺抑制骨吸收作用的细胞学机制。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  (1)实验动物:清洁级12月龄SD雌性大鼠,体重(407.25±9.26)g(用于制备针刺血清)和新生(1日龄)SD大鼠(用于分离培养破骨细胞),上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供[合格证号:SCXK(沪)2003-0002]。
  (2)主要试剂和仪器:DMEM培养基(Gibco公司产品),胎牛血清(Hyclone公司产品),萘酚ASBI磷酸钠(Sigma公司产品),二甲基二酰胺(Gen-view公司产品),副品红(上海化学试剂公司产品),CO2培养箱(德国Heraeus公司生产),超净工作台(上海净化设备厂生产),荧光倒置相差显微镜(O-lympus)。

  1.2 方法
  (1)动物分组、造模方法与针刺血清制备
  12月龄SD雌性大鼠40只,其中30只参照文献方法去除双侧卵巢后随机分为模型组、针刺预防组和针刺治疗组,10只仅去除卵巢附近少量脂肪作为假手术组。除假手术组和模型组外,针刺预防组和针刺治疗组分别于去除卵巢术后3 d和3个月开始针刺。参照《实验针灸学》实验动物(大白鼠)常用腧穴简表及南京中医药研究所华兴邦制定的大白鼠取穴标准,取“肾俞”“脾俞”“足三里”“大椎”,电针疏密波,2Hz,强度以大鼠肌肉轻微抖动为度,每次15min,隔日1次,10次为一疗程,疗程间休息5d,两组均针刺3个疗程。各组大鼠于针刺疗程结束后1h,眼球取血,离心(3000r/min)30min,取血清,同组血清混合,56℃、30mim灭活,经0.22/μm微孔滤膜过滤除菌,-30℃保存备用。

  (2)破骨细胞分离与培养
  取新生(24h以内)SD大鼠用蒸馏水冲冼,75%酒精浸泡2min,于超净工作台上无菌条件下取四肢长骨(股骨、胫骨、肱骨),用磷酸缓冲液(PBS)洗数次,清除附于骨干上的软组织及肌肉,置于含有15%胎牛血清的达尔伯克氏必需基本培养基(DMEM)中将骨干刮碎,将培养液及骨碎片移入离心管,置于旋涡混合器上振荡1min,静置30s,吸取上清细胞悬液,接种于预置象牙薄片的24孔培养板内,每孔1mL,再加含有15%胎牛血清的DMEM培养液至2mL,37℃,5%CO2培养箱培养。30min后,弃去培养液,更换为含有10%不同实验组大鼠血清的培养液,继续培养。24h换液1次。
  (3)破骨细胞鉴定
  通过荧光倒置相差显微镜逐日形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色以及骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,鉴定所分离培养的细胞是否为破骨细胞。
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