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参芪复方对GK大鼠胰岛β细胞凋亡及Caspase-3表达的影响


□ 李 辉 朱天民 张卫华 谢春光

  摘要 目的:观察参芪复方对自发性2型糖尿病动物GK大鼠(Goto-Kakizaki wister rats)胰岛β细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法:选取4月龄SPF级雄性GK大鼠50只,随机分为模型组,盐酸二甲双胍组,参芪复方低、高剂量组,并另设正常Wister大鼠对照组。连续灌药4周后,TUNEL染色观察各组胰岛β细胞凋亡指数(AI),并采用免疫组化染色,Mias-2000图像分析系统观察各组大鼠胰岛β细胞Caspase-3阳性物质积分光密度。结果:模型及低剂量组β细胞AI较正常组显著增高(P<0.01),各治疗组AI显著低于模型组(P<0.01),高剂量组及二甲双胍组β细胞AI显著低于低剂量组(P<0.01)且与正常组比较无统计学意义(P>0.05);模型组及低剂量组胰岛Caspase-3积分光密度显著高于正常组(P<0.01),高剂量组、二甲双胍组Caspase-3积分光密度显著低于模型组(P<0.05)和低剂量组(P<0.01),且与正常组比较无统计学意义(P>0.05)。结论:参芪复方能够抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡,机制可能与其抑制β细胞Caspase-3表达有关。
  关键词 参芪复方 GK大鼠 胰岛β细胞凋亡 Caspase-3
  
  参芪复方主要由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄等组成,具有益气养阴、清热生津、活血化瘀的功效,在临床使用取得了较好的疗效。以往研究提示,参芪复方具有抗2型糖尿病早期动脉粥样硬化、低度炎症的作用[1-2],但其对胰岛β细胞凋亡的影响未见报道。本研究观察了其对自发性2型糖尿病动物GK大鼠胰岛β细胞凋亡的影响并对其可能作用机制进行了初步探讨。
  
  1 材料
  
  1.1 动物:4月龄雄性SPF级自发性2型糖尿病GK大鼠50只及正常Wistar大鼠10只(中国科学院上海实验动物中心提供),按2~3只/笼饲养于独立通气笼具(IVC)系统内。
  1.2 主要药品与试剂:参芪复方浸膏粉(1g浸膏粉相当于原生药10g,四川大学华西药学院药厂提供,批号20031008),盐酸二甲双胍片(天津太平洋制药有限公司,批号:20040523),TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(博士德公司),Caspase-3一抗、即用型SABC试剂盒(博士德公司)。
  1.3 主要仪器:Mias-2000图象分析系统(四川大学智胜软件股份有限公司),OLYMPUS BX50型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)等。
  
  2 方法
  
  2.1 分组方法:GK大鼠适应性饲养1周后,尾静脉取血测随机血糖,随机血糖≤11.1mmol/L者剔除,共有6只[3]。余44只按血糖由高到低排列编号,依据随机排列表分为模型组、二甲双胍组、中药低剂量组、中药高剂量组,另设普通Wister大鼠正常对照组,每组11只。各组均喂饲普通饲料。
  2.2 给药方法:正常对照组和模型组予生理盐水5ml/kg·d灌服;二甲双胍组予盐酸二甲双胍125.0mg/kg·d,中药低剂量、高剂量两组分别予参芪复方0.5g/kg·d、2.0g/kg·d,共28天。
  2.3 观察指标及检测方法:有两项。
  2.3.1 β细胞凋亡计数:大鼠处死后立即取鼠胰腺组织,应用TUNEL法染凋亡细胞,试剂盒购于博士德公司,操作按试剂盒说明进行。光镜下观察凋亡细胞核呈紫蓝色,胞浆呈棕黄色颗粒。每例切片计数10个400倍视野的凋亡细胞数,然后按公式计算细胞凋亡指数(AI)。AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
  2.3.2 胰岛Caspase-3表达:大鼠处死后立即取鼠胰腺组织,用FFA液(甲醛醋酸酒精固定液)固定,石蜡包埋,滚动式切片机纵切成4μm薄片,将切片置于经防脱片剂处理后的载玻片上,使切片紧密粘附,常规脱蜡至水,余参照即用型SABC免疫组化试剂盒说明书染色。用OLYMPUS BX50光学显微镜观察染色结果,胞浆棕染为阳性,每张切片选3个胰岛,输入Mias-2000图像分析系统,在200倍镜下分别测量胰岛细胞Caspase-3阳性物质积分光密度并计算其均值。
  2.4 统计方法:用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析。方差齐采用LSD,方差不齐采用Tamhanecs’T2统计方法。
  
  3 结果
  
  3.1 一般状况:实验过程中模型组3只大鼠、低剂量组和二甲双胍组各1只大鼠死亡。其余各组大鼠无死亡。
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