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□ 陈 波 罗永芬等

  作者/陈 波 罗永芬 崔 瑾 冯玲媚 杨孝芳 冯 麟
  
  [摘 要] 目的:通过探讨机械刺激对大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞的压力信号生物转换作用,为腧穴“感受刺激,防治痰病”的现代医学生物学机制提供理论与实验依据。方法:体外培养大鼠“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞,对细胞进行形态学鉴定后,实施压力刺激并检测细胞外培养液中前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素-6(IL-6)含量的变化。结果:“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞主要都是成纤维细胞,压力刺激均能够促进细胞PGE2和IL-6合成释放的增加,差异有统计学意义。结论:腧穴与非穴的筋膜组织成纤维细胞皆能直接感受刺激,从而将机械信号转换为生物信号。
  [主题词] 穴,足三里;成纤维细胞/针灸效应,信号传递;物理刺激
  文章编号:0255-2930(2007)02-0135-06
  中图分类号:R245.2 文献标识码:A
  
  腧穴是人体脏腑经络气血输注并散发于体表的部位,它不仅能够反映病候以协助诊断,更重要的是,腧穴在感受毫针针刺与推拿按摩的机械性刺激后,还能激发出本身所固有的调节功能,从而发挥其防治疾病的作用。那么,腧穴究竟是如何感受机械性刺激,并将无机的机械信号转换为有机的生物信号的呢?目前,对此大多是从神经生物学机制的角度进行解释的,但实际上,在实施机械刺激的腧穴局部,除了各种神经装置外,其他组织和细胞也是直接暴露于治疗操作的力学环境之下的,理论上就更有可能主动地参与腧穴“感受刺激”的信号转换过程。由于在腧穴特性的研究中,“足三里”穴有着典型的代表意义,因此,对其附着组织的主要细胞群体——筋膜结缔组织成纤维细胞机械力学信号生物转换作用的研究,将有助于补充神经生物学机制对腧穴研究的不足,从而更全面地阐述腧穴“感受刺激,防治疾病”的一般生物学原理。
  
  1 材料与方法
  1.1 材料
  (1)实验动物、主要培养试剂及检测试剂
  健康3月龄雄性SD大鼠32只(由四川抗菌工业研究所动物中心提供,合格证:川实动管质第041307号),DMEM培养基(GIBCO,USA),小牛血清(GIBCO,USA),胰蛋白酶(DIFCO,USA),EDTA(SIGMA,Israel),PGE试剂盒(上海森雄公司),IL-6试剂盒(深圳晶美公司)。
  (2)主要实验器材
  C02培养箱(Heraeus,Germany),倒置相差显微镜及组像系统、体视显微镜(olympus,Japan),离心机(北京医用分析仪器厂),气压传导压力加载装置(自制),HTS 7000 Plus多孔板(紫外/荧光/可见光)高效分析仪(PE,USA),6孔培养板,100 mL细胞培养瓶,微量加样枪,滤菌器等。
  1.2 腧穴与非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代
  (1)腧穴筋膜组织细胞的原代培养及传代
  对32只SD大鼠分别进行“足三里”穴区皮下组织块取样,体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织,按酶消化法,无菌条件下剪碎组织块,移入无菌小瓶中,加入O.25%胰酶1 mL,混匀,37℃,5%C02孵箱内培养10~15 min,每5 min振摇1次;加入含10%小牛血清的DMEM培养基终止消化;离心,1000r/min,8 min,收集筋膜组织细胞;然后加入含20%小牛血清的DMEM培养基,混匀;转移至100mL培养瓶中,CO孵箱内继续培养。细胞贴壁后,每隔2天换液,每日观察生长状况,细胞生长达80%融合时,传代培养,镜下连续记录细胞形态并进行细胞形态学鉴定。
  (2)非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代
  对上述大鼠进行“足三里”穴区皮下组织块取样的同时,于穴旁5分以上距离区域同步切取皮下组织块,体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织,按相同方法获取筋膜组织细胞并进行原代培养、传代培养、生长记录及细胞形态学鉴定。
  1.3 细胞力学加载实验
  (1)气压传导压力加载装置
  气压传导压力加载装置——自制带压力表及压力气囊的压力锅;装置设计原理采用气体传导静压力的静压加压法;装置制作方法参考相关文献方法进行。
  (2)细胞在6孔板上的接种培养及加力前处理
  分别取第7~8代腧穴筋膜组织细胞和非穴筋膜组织细胞,弃培养液,加入O.25%胰酶和O.1%EDTA混合消化液消化细胞,约3~5 min;当瓶底出现针孔样透明时,用含10%小牛血清的DMEM终止消化细胞,调整细胞密度,按2×10。/mL接种于6孔培养板;显微镜下见细胞完全贴壁生长后,继续培养72h;弃含10%小牛血清的DMEM培养液,准确更换含5%小牛血清的DMEM培养液3 mL,再培养24h,使细胞同步化,备用。
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