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线粒体DNA的异质性与检测方法


□ 刘 艳 胡 婧 黄 原

  摘要:线粒体DNA的异质性在生物学、医学、法医、生物技术等领域有重要的应用。本文从自然发生(包括体细胞突变、父系渗入和杂交)和人工产生(包括转基因、细胞融合、核移植和转线粒体)两大方面系统地介绍了线粒体DNA异质性的产生机制及其遗传。并介绍了线粒体DNA异质性的检测方法,已知突变位点mtDNA异质性的检测方法有原位PCR技术、PCR-RFLP和实时荧光定量PCR技术,未知突变位点mtDNA异质性的检测方法有长PCR技术、时相温度梯度凝胶电泳(TIGE)和变性高效液相色谱(DHPLC)等。最后对克隆生物中线粒体异质性检测的应用实例作了介绍。
  关键词:mtDNA;异质性,父系渗入,细胞融合,核移植;转线粒体,检测
  中图分类号:Q953文献标识码:A文章编号:0250-3263(2006)05.120-07
  
  1 线粒体DNA的异质性
  
  一个生物体中一般仅有一个类型的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)。当不止一种类型的mtDNA在单个个体中存在时称mtDNA的异质性(heteroplasmy),也就是说,同一个体同时存在两种或两种以上类型的mtDNA。并且异质性发生的频率和多态性水平在不同组织和个体中是不同的,在肌肉组织和衰老个体中发生频率较高。
  异质性可分成长度异质性和位点异质性两类。长度异质性(length heteroplasmy)的大多数情形是线粒体基因组的某一段,主要是D环区的串联重复。现存的长度异质性多被认为是中性选择的结果。位点异质性(siteheteroplasmy)表现在一个或多个核苷酸位点上不同的mtDNA,即主要是由于DNA上某个或数个碱基的转换、颠换、插入或缺失等点突变所产生的,引起个体内的mtDNA异质性。异质性点突变的速率是随年龄而增长的,如C-stretch区发生异质性突变的速率就反映此规律。位点异质性极少数是具有病理性的,大多都为中性突变。异质性的细胞在连续分裂过程中会发生遗传漂变,这使得细胞中突变型mtDNA的比例从0%~100%之间变化。
  线粒体DNA的异质性在生物学、医学、法医和生物技术等领域有重要的应用。本文系统地介绍线粒体DNA异质性的产生机制、遗传规律、检测方法及在克隆生物中的应用实例。
  
  2 自然发生的线粒体DNA的异质性及遗传
  
  2.1体细胞突变形成的异质性 个体在生长发育过程中,体细胞中的mtDNA会发生突变,由此引起个体不同组织或细胞的线粒体具有异质性。mtDNA缺乏组蛋白保护,与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近,较易受自由基攻击,氧化损伤从而引起突变;复制快速且无校读功能以及缺乏有效的DNA修复机制,因而具有较高的复制错误率及较低的修复能力,所以其突变率是核DNA的10~20倍,其相应的进化速度比核DNA快5~10倍。因此,随着时间的推移,同一个体发生部分突变的mtDNA不断复制,进而形成了具有异质性的细胞亚群。
  体细胞突变可发生在个体的不同时期,并且这种突变能引起个体病变。通常是随着个体年龄的增加,它们的突变数目也随之增加,当mtDNA突变数目达到某一阈值(threshold level),大多为60%或更高,便可引起某组织或器官功能的病变,即阈值效应(threshold effect)。这个阈值的变化范围是依赖于突变类型、组织类型和需氧条件等因素,但最主要的影响因素是年龄,且这种阈值随年龄的变化而影响显著,年龄越大的个体,其阈值越低。
  20世纪90年代早期,在多种动物(秀丽线虫Caenorhabditis elegans、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、小鼠Muc muculas、恒河猴Macacamulatta、黑猩猩Pan troglodytes和人类HomoSapiens)中发现,线粒体基因组的重组现象也与衰老密切相关。年龄相关的mtDNA突变主要发生在后有丝分裂的组织中,大多情况下,这些突变都是异质性的(突变和野生型mtDNA共存),并且小比例的野生型基因具有强的保护效应来对抗线粒体的代谢缺陷症。
  线粒体DNA也普遍存在多缺失(multxpledeletions)现象,研究表明这种mtDNA的多缺失是与各种病变情况相关,特别是肌病(myopathy)、多肌肉痛、风湿性关节炎、心肌症以及自然衰老的疾病有关。
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