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乙酰胆碱酯酶在尼龙网上的固定化研究


□ 周祖新 丁 慧 郭晓明 王根礼 叶伟林

  摘要:以尼龙网为全体,分刺用硫酸二甲酯和三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂使尼龙网活化。然后将尼龙网浸入一定浓度的乙酰胆碱酯酶溶液中,置于4℃条件下进行固定化,获得了较好的固定化效果,醇膜活性分刺达到4.2 U/cm2和11.1 U/cm2,固定化效率分别达到24.2%和64.1%。重现性好,稳定性好,5个月后活性无明显下降。
  关键词:乙酰胆碱酯酶;固定化;醇片;生物传感器
  中图分类号:Q 814.2
  文献标识码:A
  文章编号:0367-6358(2007)12-751-04
  作者简介:周租新(1963-),男,上海人,硕士,副教授,主要从事化学传感器和生物传感器的研究。
  
  有机磷农药和氨基甲酸酯类农药杀灭害虫的机理是利用该农药抑制生物体中乙酰胆碱酯酶的活性,使酶活性减弱或失去催化水解乙酰胆碱的功能,从而将害虫致死。利用这一特性,可将乙酰胆碱酯酶固定后制成酵传感器,用于检测水体,土壤和果蔬中的农药残留。对乙酰胆碱酵酶传感器而言,酶的固定化是其制作的关键技术,它决定着酶传感器的灵敏度,稳定性和选择性及有无实用价值。
  酶的固定化方法主要有吸附法,包埋法,交联法和共价法。用吸附法或包埋法等物理方法固定酶,活性较高,但在测定过程中酶易泄露,流失,稳定性差;用戊二醛交联法由于试剂对酶的损害作用,固定化酶的活性较低,本文以尼龙网为载体,采用共价键法固定酶,使酶既保持较高的活性,又有很好的稳定性。
  
  1 实验部分
  
  1.1仪器和试剂
  722型分光光度计(上海棱光分析仪器厂);PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);79-2型磁力搅拌器(金坛市科析仪器有限公司);尼龙网(100目),上海吴淞筛网厂;乙酰胆碱酯酶(Ec3.1.17)取自电鳗,活力为695 U/rag,Fluka公司;碘化硫代乙酰胆碱(ATCh),Fluka公司;硫酸二甲酯(DMS)(提纯)上硫化工股份有限公司,5,5.双二硫代(2.硝基)苯甲酸(DTNB)。磷酸氢二钠磷酸二氢钠,环氧氯丙烷。三氟化硼乙醚溶液(均为分析纯),国药集团。
  
  
  
  1.2实验方法
  1.2.1载体的处理
  (1)以硫酸二甲酯作烷基化试剂
  取一面积约为12 mm×12 him的尼龙网,在75aC烘箱中活化5 rain后,于室温下浸入硫酸二甲酯中反应3 min,将尼龙网迅速取出放入无水甲醇中浸30 B,另换甲醇再浸30 8。晾干后在室温下,将此尼龙网与0.5 moL/L赖氨酸反应4 h。用0.2 mol/L NaCl溶液洗去尼龙网上残留的赖氨酸后,将此尼龙网放入12.5%戊二醛水溶液中反应40 mill,取出后将此尼龙网用0.2 tooL/L NaCI溶液清洗数次,抽干。
  (2)以三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂
  在46℃时,将500 mL 10%(质量分数)环氧氯丙烷干乙醚液慢慢滴加到200 mL 5%(质量分数)三氟化硼干乙醚溶液中,同时搅拌,回流1 h后,常温下再搅拌3 h,即生成三乙基肟四氟化硼沉淀。用干乙醚洗涤沉淀3次,每次用量30 mL,然后按10%比例将沉淀溶3氯甲烷中,待用。
  室温下将尼龙网浸在0.5 mol/L HCl溶液中活化30 min,取出后用蒸馏水冲至洗出液呈中性。将此尼龙网浸入新鲜合成的10%(质量分数)三乙基肟四氟化硼二氯甲烷溶液中,反应7 min后,依次用二氯甲烷和二氧六环各清洗2 min,随即在室温下与10%(质量分数)已二胺甲醇溶液反应3 h,之后用蒸馏水将尼龙网清洗13 h,吸干,再用无水甲醇清洗尼龙网约15 min,最后尼龙网与5%(质量分数)戊二醛溶液反应30 min后,用无水乙醇清洗尼龙网数次,抽干。
  
  1.2.2乙酰胆碱酯酶的固定化
  在4℃下,将预处理过的尼龙网浸入一定量的乙酰胆碱酯酶溶液中,置于冰箱内若干小时进行固定化。取出后依次用0.2 mol/L的甘氨酸、0.2 moltL NaCI溶液和0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)清洗网膜,即得固定化酶膜。将此固定化酶膜浸在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)中于4℃下保存。
  1.2.3乙酰胆碱酯酶的活性测定
  (1)非固定化酶的活性测定
  参照EllmantSj的方法,稍作修改:在1 cm比色皿内,准确加入3.0 mL磷酸盐缓冲液(0.1 moL/L,pH=8.0)和20酶液(5 U/mL),混匀片刻,再依次加入100DTNB溶液(终浓度为1.0 mmol/L)和20ATCh溶液(终浓度为1.0 mmoL/L),迅速混匀。在412 nm处,每隔15 s读取吸光度数值,连续测定3~5 mln。第一支比色皿不加ATCh,作为空白调零。根据1 min内的吸光度变化值来计算酶的活力,计算公式如下: 酶活力U(pmol/min)=v x A×50/(k×l)(1)式中:A-吸光度随时间的变化率(1/min),即一分钟内吸光度的变化值;
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