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大菱鲆红嘴病的病原分离鉴定与系统发育分析


□ 高晓田,肖国华

  高晓田 肖国华

  (河北省水产研究所,河北省海洋生物资源与环境重点实验室,河北 秦皇岛 066601)

  摘 要:从患“红嘴病”的大菱鲆(Scophthalmus maxrmu.s)肝脏和眼睛内分离到20080602DW1和20080602DY1两株优势菌。人工感染实验证实这两株菌对大菱鲆幼鱼有较强的治病性,将0080602DW1和20080602DY1按O.l mL/尾的剂量腹腔和肌肉注射,皆可引起感染鱼loo%的死亡,症状与自然发病相似。两株细菌的16SrDNA测序结果在GeneBank进行序列对比分析,并采用MEGA4软件进行系统发育树评估,初步确定两种株菌均为希瓦氏菌属的种类。

  关键词:大菱鲆;红嘴病;希瓦氏茵;16Sr DNA

  2008年5月在河北、辽宁部分大菱鲆养殖场相继发生了养殖大菱鲆“红嘴病”,并造成较大伤亡。对该病的病原进行分离、纯化,并将纯化的菌株进行回接感染实验,确定了两株菌具有高度的治病性。对两株菌的16SrDNA测序结果进行同源性分析以及系统发育树评估,初步确定了这两株菌的种属地位。

  1材料和方法

  1.1 病原分离

  患病大菱鲆来自辽宁新城一养殖场,病鱼吻端及上下颌出血,部分鱼鳃盖有出血的溃烂小凹洞,口腔内出血,部分病鱼眼睛肿大突出、挑破内有大量脓液,肠道充血无食物肠道末端有少量粘稠液体,肝脏充血、色暗淡呈糜散状,脾脏肿大发红。无菌生理盐水清洗体表3遍后,用灭菌的解剖刀刮病灶,如鳃盖溃烂的小洞,吻端红肿部位,及脓肿的眼睛,然后用接种环挑取破碎的病灶组织划线接种到2216E培养基上。然后将病鱼解剖,用无菌解剖剪剪开肝脏,用接种环挑取部分肝脏组织划线接种到2216E培养基上。28℃培养.48 h,挑取优势菌落进行划线纯化,将纯化的菌落接种到试管斜面上4℃保存。

  1.2人工感染实验

  将分离出的优势菌进行平板培养,接种环挑取单菌落于无菌生理盐水中,制成菌悬液。每组实验用鱼6尾,按0.1 mL/尾的量进行注射,其中腹腔注射4尾、肌肉注射2尾。空白对照一组,按0.1 mL/尾的量注射无菌生理盐水。实验鱼体长11 cm左右,体重约10 g。实验条件为10 L水体中放入6条鱼,充气,每日两次投饵。每日换水量大约50%左右,水温15~17℃。对照组采用与以上相同的条件进行培养,实验过程中,每日观察记录实验鱼的体色、活动力、摄食、发病症状和死亡情况。

  1.3病原鉴定

  将保藏的20080602DW1和20080602DY1两株菌在2216E固体培养基上活化并重新纯化三次,接种于试管斜面上,再经过24 h培养后,放到泡沫保温箱内,并用冰块降温,邮寄到上海生工进行16SrDNA测序。将测序结果分别通过NCBI的Blast检索系统(http://www. ncbi. nlm. nih.govlBlast/)进行序列同源性分析,将相似度最高的前20株菌的基因序列,用MEGA 4软件通过自举分析(Boot strapping)进行系统发育树的评估,自举数据集为1 000次,采用邻位相连法(Neighbor-joining)获得系统发育树。

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摘自:河北渔业
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