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益心通脉胶囊对糖尿病性冠心病大鼠缺血心肌肝细胞生长因子的影响


□ 孙新宇 杨玉莲 栗德林

  关键词 益心通脉胶囊 糖尿病性冠心病 缺血心肌肝细胞生长因子 实验研究
  糖尿病冠心病是糖尿病慢性大血管并发症之一,也是糖尿病致死的最主要原因,其病死率在2型糖尿病中达50%,在1型糖尿病中高达75%,比非糖尿病者高2~4倍[1]。我们根据多年的临床经验选用玄参、黄芪等组成了益心通脉胶囊,用于气阴两虚夹痰瘀型糖尿病性冠心病。为探讨益心通脉胶囊对糖尿病性冠心病大鼠心肌组织肝细胞生长因子(HGF)阳性表达的影响,我们进行了如下动物实验研究。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 实验动物:Wistar大鼠,体重200~250g,黑龙江中医药大学动物实验中心提供,动物合格证号为:黑动字第P00102004号。
  1.2 药剂与试剂:益心通脉胶囊(由玄参、黄芪、丹参等中药组成),由黑龙江中医药大学中药制剂室提供。复方丹参滴丸,天津天士力集团生产,批号:990408;格列吡嗪,珠海联邦制药有限公司分厂生产,批号:000419;垂体后叶素,上海生物药厂生产,批号:960923,规格为10U/ml×10支;四氧嘧啶,美国Sigma公司;HGF原位杂交检测试剂盒,武汉博士德生物工程公司。
  1.3 实验方法:分如下几步进行。
  1.3.1 造模及分组:Wistar大鼠,体重200~250g,共60只,一次腹腔注射四氧嘧啶200mg/kg,3天后大鼠空腹禁食(不禁水)8h测血糖≥9.99mol/L为造模成功。取20只正常Wistar大鼠,10只作为正常空白组,10只作为丹参滴丸组。将造模成功的大鼠随机分为5组:分别为模型组、美吡达组、益心通脉胶囊高剂量组、益心通脉胶囊中剂量组、益心通脉胶囊低剂量组。每组各10只。
  1.3.2 给药剂量及方法:灌胃法给药,每日1次,连续4周,给药剂量根据人临床剂量按动物体表面积换算。益心通脉胶囊高剂量组1.296g/kg·d,益心通脉胶囊中剂量组0.648g/kg·d,益心通脉胶囊低剂量组0.324g/kg·d;美吡达0.36g/kg·d;丹参滴丸13.5g/kg·d,正常组和模型组每日灌胃等容量蒸馏水。
  1.3.3 取材方法:于实验结束时,禁食不禁水12小时后,取出心脏,立即投入固定液中固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0~pH7.6),含有1/1000DEPC。固定1小时。
  1.3.4 检测方法:HGF原位杂交检测,严格按试剂盒说明操作,具体步骤如下:①常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6~8μm。②玻片的处理:采用多聚赖氨酸(POLY-L-LYSINE)裱于处理过的载玻片上,置60℃烤箱中烤8小时。③石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2室温处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。④暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化30分钟。胃蛋白酶的消化对原位杂交的结果是至关重要的。充分的消化可以使mRNA得到暴露,从而加强杂交信号,而过度的消化又使切片明显减薄乃至消失,从而失去杂交信号。在实验中,通过反复比较,我们认为30分钟是最佳消化时间。⑤0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。⑥后固定:切片入1%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.2~pH7.6)含有1/1000DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗3次。⑦湿盒的准备:干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液,恒温箱38℃4小时,吸取多余液体,不洗。⑧杂交:按每张切片20μ1HGF寡核苷酸探针杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38℃杂交过夜。⑨杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃水温的0.5×SSC洗涤15分钟×1次;37℃水温的2×SSC洗涤15分钟×2次。⑩滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗。○11滴加生物素化鼠抗地高辛:室温120分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。○12滴加SABC:37℃20分钟。0.5M PBS洗5分钟×3次。○13滴加生物素化过氧化物酶:室温20分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。○14 DAB显色:显色20~30分钟。显微镜下控制显色,充分水洗。○15苏木素复染,充分水洗。○16酒精脱水,二甲苯透明,封片。
  1.3.5 统计分析:采用半定量法进行判定,以半定量计分:1、2、3、4分别对应-、+、++、+++。每张切片至少观察3个视野
  
  2 结果
  
  将原位杂交结果进行定量分析,结果表明正常对照组和模型组的阳性率分别为20%和85.7%,两组间差异非常显著(P<0.01)。益心通脉胶囊高、中、低剂量组大鼠经过治疗后,心肌组织HGFmRNA的阳性表达明显增加,与模型组相比,阳性积分差异非常显著(P<0.01)。丹参滴丸对照组大鼠经治疗后,心肌组织HGFmRNA的阳性表达亦有所增加,与模型组相比,差异显著(P<0.05),见表1。
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