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从皂浆废液中提取核苷酸


□ 肖 红 张熊禄 范小林

  核苷酸是生物体内重要的低分子化合物,具有许多生理功能。除作为DNA,RNA的前体,也作为生理生化过程的调节物质。核苷酸广泛应用在医药、食品、农药等领域。作为医药中间体,核苷酸主要用来制造腺苷三磷酸、环腺苷酸、胞二磷胆碱、聚肌胞等抗病毒,抗肿瘤,治疗心血管疾病的药物;作为食品添加剂,主要用作鲜味剂和配方奶粉中营养强化剂。正因为核苷酸独特的功效和作用,其应用范围越来越广,需求量也越来越大。
  提取核苷酸方法主要有以下几种:高效毛细管电泳技术、离子交换层析法、高效液相色谱法。本文用交换层析技术从皂浆废液(酵母碱性水解液)中提取核苷酸进行研究,获得了较好的结果。
  
  1 实验部分
  
  1.1主要仪器
  Cintra 10型紫外可见分光光度仪:澳大利亚GBS公司。UNIC-2102PCS型紫外可见光谱仪:CONIC上海仪器有限公司。所用试剂均为市售CP或AR。
  
  1.2实验
  1.2.1操作步骤
  (1)样品的处理 取一定量的皂浆废液,用2 mol/L氢氧化钠溶液调至pH值2以下,以4000 r/min的转速离心15 min,去上清液。
  (2)装柱
  用水浸泡717型阴离子交换树脂,并利用浮选法除去细小颗粒,使用时先用0.5 mol/L氢氧化钠溶液浸泡1 h,以除去碱溶性杂质,然后用无离子水洗至中性。再用l mol/L盐酸浸泡30 min。以除去酸溶性杂质,再用无离子水洗至中性。然后用1 mollL甲酸钠溶液浸泡,使树脂转变成甲酸型。
  取酸式滴定管,在柱底部铺一小块脱脂棉,防止树脂流出。将上述处理好的树脂悬浮液倒入管内,用l moi/L甲酸钠洗至无氯离子。再用无离子水洗至中性,慢慢放出液体,使液面与树脂表面刚好相平。树脂床高度为30 em左右。
  (3)加样
  从清液中取出10 mL样品。用2 mol/L氢氧化钠溶液调至pH值7。将样品小心地加到交换树脂上,待样品全部进入树脂后,用250 mL无离子水洗柱。以除去核苷、碱基等杂质。
  (4)洗脱
  用无离子水洗至在紫外分度计上波长260 nln处无光吸收(光吸收值低于0.020)后,依次用(a),250 mL 0.15 mol/L甲酸溶液;(b)250 mL 0.15 mol/L甲酸溶液;(c)250 mL pH4.44的甲酸,甲酸钠溶液;(d)250 mL pH值3.74的甲酸,甲酸钠溶液进行洗脱。用收集器收集流出液,控制速度为5。6 mL/15min。重复(2)、(4)的实验步骤,分别从pH值8、9、10、I1、12、13的样品液中提取核苷酸,记录数据
  
  1.3数据处理
  核苷酸浓度的计算:c=A260nm/K260nmxI
  A260nm。:在260nm波长下的吸光度。将被测溶液调至pH为2,已知在260nm波长下摩尔吸光系数(K260 nm)分别为胞苷酸(cMP)是14.5×103m2,mol,腺苷酸(AMP)12.3×10m2/tool,尿苷酸(UMP)为色池的光程,I=1 Cm。c:单位为mol/L。
  
  2 结果与讨论
  
  2.1 pH值为核苷酸提取的影响
  分别在不同的pH条件下提取核苷酸的实验研究,结果见表1。
  由表1可知pH值等于9时,各核苷酸的浓度最大(除CMP浓度)。随着pH的增大(pH值从9变到13时),被洗脱下来的各核苷酸的浓度也相应减小。这是由于pH>PI时,被分离的核苷酸带负电,两者之间的差异越大,分子带的负电荷越多。洗脱时。被吸附的单核苷酸所带的电荷越多,其亲和力越大,越不容易被洗脱下来。
  
  2.2流速对核苷酸提取的影响
  流速对核苷酸提取的影响实验研究,结果见表
  由表2可知,流速为1.0 mL/min,被洗脱下来的各核苷酸的浓度越大。流速慢。洗脱液的离子流过介质所需要的时间长,容易与介质发生交换作用。否则相反。不易与介质发生交换作用。但流速过慢也会影响交换介质的交换。
  
  2.3洗脱液对核苷酸提取的影响
  分别进行了在不同洗脱液下提取核苷酸的实验研究,结果见表3。
  1):洗脱液1是0.02 mol/L甲酸溶液,0.t5 mol/L甲酸溶液,0.01mel/L甲酸-0.05md/L甲酸钠溶液。0.1 m0l/L甲酸-0.1甲酸钠溶液。洗脱液2是0.02mol/L的乙酸溶液。0.15 mol/L己酸溶液。0.01 mt/L乙酸0.05 mol/L乙酸钠,0.1 mol/L乙酸,0.1 mo]/L乙酸钠溶液。
  由表3可知洗脱液1能更好的把单核苷酸洗脱下来。这是因为,在相同浓度的情况下,甲酸的极性比乙酸强,更容易把被吸附的核苷酸洗脱下来。
  
  2.4核苷酸总提取率
  分别在不同的pH值,测出皂浆废液离子交换前与交换后的吸光度,由公式c=A260nm/k260nm*i*1.4,计算出离子交换前的总浓度和离子交换后提取核苷酸的总浓度(每一个pH所对的四种单的核苷酸浓度之和),计算结果表明当pH 9时,核苷酸总提取率为(86.7%)最高。
  
  3 结论
  
  从皂浆废液中提取核苷酸时用2 mol/L的氢氧化钠将样品调至pH 9,流速控制在1.0 mol/min,依次用0.02 mol,L的甲酸溶液,0.15 mol/L的甲酸溶液,0.01 11101,L的甲酸10.05 mol/L的甲酸钠溶液,0.1 mol/L的甲酸0.1 mol,L的甲酸钠溶液,洗脱时条件最佳,核苷酸的提取率是86.70%。
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