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青少年肾阳虚体质差异表达基因的筛选研究


□ 倪红梅何裕民方盛泉

  摘要 目的:利用基因芯片技术筛选、分析青少年肾阳虚体质者外周血白细胞的差异表达基因,从基因水平探究青少年肾阳虚体质的内在机理。方法:通过针对性调查,对154例16~24岁青少年进行问卷调查,筛选典型的青少年肾阳虚体质者。利用体外转录方法,将青少年肾阳虚体质组与同年龄段正常体质组外周血白细胞mRNA,合成为标记有不同荧光的cDNA探针,运用杂交互补原理筛选差异表达基因。结果:共筛选出127条符合筛选标准的差异表达基因,其中63条呈上调表达,64条呈下调表达。结论:与青少年肾阳虚体质相关的基因表达涉及到免疫相关、细胞周期蛋白、原癌基因和抑癌基因、代谢、离子通道和运输蛋白、细胞骨架和运动、DNA结合、转录和转录因子、细胞受体、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成等。其中CCNH基因与PSMB7基因的表达差异最大,提示这两条基因可能与青少年肾阳虚体质密切相关。
  关键词 基因芯片 肾阳虚体质 筛选 差异表达 青少年
  
  中医对体质的研究由来已久。然而,由于中医对体质的研究主要局限于经验的总结,从而使得中医体质理论体系的发展还不够完善。体质研究长期未见重大突破,很重要的一点是尚未能从生物学水平,特别是分子或基因水平揭示其某些特异性[1]。中医体质的现代研究,尤其是利用基因技术进行深究,以从微观世界探求不同体质类型产生的内在基础,并对其机理进行科学诠释,具有重要的现实意义。
  肾在体质中的地位极为重要,肾阳虚体质在临床上具有典型意义,尤其是青少年肾阳虚体质者存在一定的遗传倾向性。本课题以基因芯片为研究平台,旨在利用其高通量、大范围、高度平行性和快速高效等特性,从研究青少年肾阳虚体质者外周血白细胞的基因表达入手,比较青少年肾阳虚体质者与同年龄段正常体质者外周血白细胞的基因表达异同,以筛选差异表达基因。以期在分子及基因水平对深入研究青少年肾阳虚体质的内在机理提供更全面、更可靠的指导,尝试在基因时代,对中医体质学说的创新性研究进行初步探索
  
  1 筛选研究
  1.1 研究对象:本次研究的154例对象为上海市16~24岁年龄段的青少年,其中男性42例,女性112例。采用问卷调查方式针对性进行“中国人体质问卷”(Chinese Constitution Questionnaire,CCQ)[2]调查及肾阳虚体质问卷调查。
  1.2 研究方法:分述如下。
  1.2.1 制定调查问卷:本研究使用CCQ问卷,该问卷已经在国家自然基金项目和国家中医药管理局课题中多次运用,并多次在临床中应用。所使用的青少年肾阳虚体质调查问卷,是结合导师指导下多年来进行的体质调研结果(大样本的体质流调,约4万人次),经过模糊聚类后形成的体质分类标准基础上制定的。以上问卷标准能够比较真实地筛选研究对象。
  1.2.2 青少年肾阳虚体质的纳入标准:试验组纳入标准:同一年龄段(16~24岁),汉族,直系亲属内至少有一名肾阳虚体质者,本人符合青少年肾阳虚体质的判断标准;排除疾病、证和其它体质类型者。对照组纳入标准:同一年龄段(16~24岁),汉族,直系亲属内无肾阳虚体质者,经查体排除疾病、证、病理体质类型的正常青少年。
  1.2.3 青少年肾阳虚体质的排除标准:①不符合青少年肾阳虚体质判断标准者;②有明显的兼夹其它体质类型或合并其它体质类型者;③哺乳、妊娠或正准备妊娠的妇女;④过敏体质及对多种药物过敏者;⑤合并心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等严重原发性疾病、精神疾患者。
  1.2.4 青少年肾阳虚体质的判断标准:依据导师既往研究结果,经过模糊聚类和神经网络训练后形成的体质分类标准,并参考《中药新药临床研究指导原则》[3]制定。
  
  2 实验研究
  2.1 材料与方法:分述如下。
  2.1.1 实验对象:根据前述标准,并经4位高级职称的中医专家分别辨质判断,154例观察对象共筛选出肾阳虚实验组6例。其中男1例,女5例,年龄在16~24岁之间。同法选取正常体质对照组7例,其中男2例,女5例,年龄在16~24岁之间。
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