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纤维素酶降解结合膜法制备低聚壳聚糖


□ 韩永萍 林 强

  (北京联合大学生物化工学院,北京100023)
  摘要:研究纤维素酶降解结合膜法制备低聚壳聚糖。采用正交设计优选酶降解的最佳工艺条件及分析超滤产品的平均相对分子质量和收率。纤维素酶对壳聚糖降解的最佳条件为:温度50℃,酶糖质量比为0.1,pH=4.6。纤维素酶催化降解结合膜法制备低聚壳聚糖。在5 h内即可获得收率超过75%,平均相对分子质量在5000左右的优质低聚壳聚糖产品。该工艺简单可行,运行时间短,产品相对平均分子质量小而且分布窄,收率较高。
  关键词:壳聚糖;低聚壳聚糖;降解;纤维素酶;超滤
  中图分类号:0636.1 文献标识码:A
  文章编号:0367-6358(2007)02-098-04
  壳聚糖是一种为数不多的天然碱性多糖,其资源量仅次于纤维素,相对分子质量从几十万到几百万不等。被誉为人体所必需的第六生命要素。降解后相对分子质量低于1万的低聚壳聚糖因溶解性增强、容易被吸收利用,显示出独特的生理活性和功能:如激活T淋巴细胞与巨噬细胞相互加强作用;抑制肿瘤细胞的生长和转移;具有优良的吸湿和保湿性能,消除皮肤毛囊中的黑色素、色斑以及增强植物对病虫害的防御功能,参与植物的生长发育。因此,低壳聚糖在保健食品、医药、化妆品和农业等方面具有广阔的应用前景。
  目前对壳聚糖的降解方法大致分为酸降解法、酶降解法和氧化降解法三大类。其中酶降解法由于无副反应、降解条件温和、降解过程及降解产物相对分子质量分布容易控制、制备的低聚壳聚糖生物活性高,而引起人们的广泛关注。但是降解性能较好的专一性酶目前还没有工业化生产,使用成本较高。而纤维素酶在糖苷键的连接上与壳聚糖具有相似之处,对壳聚糖具有一定降解作用,并且生产成本较低。但存在纤维素酶活力有限,降解时间长,降解产物相对分子质量分布较宽等问题。
  膜处理作为一种新型的分离技术,可用于多糖、酶等热敏性活性物质的分离与纯化。因收率高、无相变化等,成为当前分离工程研究中十分活跃的领域,但用于低聚壳聚糖的提取分离报道较少。本文将纤维素酶降解与超滤、反渗透相结合,在降解过程中及时取出低聚壳聚糖产品并回收纤维素酶,详细研究了纤维素酶的催化降解过程及超滤对降解产品的提取分离,为工业化开发高品质、窄分布的低聚壳聚糖产品提供理论依据和技术指导。
  
  1 试验材料、方法
  
  1.1试验材料与主要仪器设备
  壳聚糖,济南海得贝海洋生物工程有限公司,脱乙酰度>90%;纤维素酶,天津丽华制剂厂,酶活力≥40000μ/mg;冰醋酸,分析纯;T-系列葡聚糖标准品(生化试剂,Pharmacia公司生产,北京生物经科生物技术公司分装)。
  中空纤维超滤器:天津膜天工程公司提供的实验室超滤装置;改性聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维超滤膜组件,截留相对分子质量为10 kDa;反渗透装置,上海亚东核级树脂有限公司提供;LC.10AD凝胶色谱仪(日本岛津),RID 10A示差检测器,工作站为CLASS-VP。
  1.2试验方法
  纤维素酶催化降解试验:在搅拌的情况下,将壳聚糖按1:50(W/V)与去离子水混合,并加入适量冰醋酸使其完全溶解后,快速升温到所需的温度,加一定量的纤维素酶恒温反应一定时间后降温,卸料、板框压滤、喷雾干燥。在降解过程中用凝胶色谱跟踪分析降解产物的相对分子质量。
  酶降解结合膜法制备低聚壳聚糖试验:在纤维素酶的最佳催化降解条件下降解反应一段时间后,每隔0.5 h超滤20 min取出一部分相对分子质量低的产品。超滤截留的纤维素酶和相对分子质量大的产品返回系统继续降解。将超滤取出的相对分子质量低的产物进行反渗透浓缩,干燥。分析超滤截留液和透过液中壳聚糖的相对分子质量和反渗透浓缩液干燥品的质量,计算产品收率。
  1.3相对分子质量测定条件
  色谱柱为日本产TSK G4000SW,流动相为0.2mol/L CH,COOH+0.1 mol/L CH,COONa缓冲液,将T.系列葡聚糖标准样品溶于流动相,配制成4g/L,用0.45 μm过滤器过滤后每次进样20μL,控制柱温和检测池温度为40℃、流速为1.0 mL/min测定相对分子质量。用普适校正后得GPC方程式logMw=-0.042x3+1.167x2-11.2757x+42.3141。将样品在相同条件下进行相对分子质量测定,代入普适方程计算重均相对分子质量Mw和分散度PD。
  1.4正交实验设计
  
  
  2 结果与讨论
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